Wybrane techniki laboratoryjne stosowane w Zakładzie:
Test kometowy (ang. Comet assay)
Test kometowy czyli elektroforeza pojedynczych komórek, jest metodą analityczną umożliwiającą ocenę stopnia fragmentacji DNA, po działaniu czynników genotoksyczny. Przy zastosowaniu tego testu możliwa jest identyfikacja zarówno pęknięć jedno jak i dwuniciowych. Metoda ta umożliwia detekcję uszkodzeń DNA już na poziomie pojedynczej komórki. W technice tej wykorzystuje się materiał biologiczny taki jak krew czy tkanka, z których uzyskuje się zawiesinę komórek, poddawanych dalszej analizie. W celu przeprowadzenia tego testu otrzymane komórki zawiesza się w żelu agarozowym, a następnie szkiełko poddaje się elektroforezie i w końcowym etapie wybarwia się je barwnikiem fluorescencyjnym. Uzyskuje się obraz w postaci „komet”. „Głowa” to miejsce unieruchomienia komórki przed lizą, „ogon” to uszkodzone fragmenty DNA. Miarą poziomu uszkodzeń DNA jest długość ogona i ilość zawartego w nim DNA.
Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (od ang. polymerase chain reaction)
metoda powielania DNA polegająca na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki, w warunkach laboratoryjnych. PCR znajduje wiele zastosowań. Wymienić tutaj należy: klonowanie genów, diagnostykę kliniczną, kryminalistykę, identyfikację osób zaginionych, paleontologię, ustalanie ojcostwa czy diagnostykę chorób dziedzicznych. Wykorzystujemy ją często w sytuacji, kiedy dysponujemy niewielką ilością materiału badanego.
Western Blot
Służy do detekcji określonych białek, jak również do analizy poziomu ich ekspresji. Metoda składa się z kilku etapów. Pierwszy obejmuje przygotowanie próbek z mieszaniną białek o określonym stężeniu, uprzednio wyizolowanych z komórek. Próbki poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w celu ich rozdzielenia według mas cząsteczkowych. Następnie rozdzielone białka w żelu zostają przeniesione na membranę w wyniku działania pola elektrycznego. W kolejnym etapie, membranę z białkami inkubuje się w buforze blokującym, co uniemożliwia niespecyficznemu wiązaniu się przeciwciał do białka. Następnie, membranę inkubuje się z nieznakowanymi, specyficznymi, rozpoznającymi pożądane białko przeciwciałami pierwszorzędowymi a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi, sprzężonymi z barwnikiem fluorescencyjnym i rozpoznającymi przeciwciała pierwszorzędowe. W ostatnim etapie wykonuje się detekcję pożądanych białek z wykorzystaniem zjawiska
chemiluminescencji.
Hodowle komórkowe
W Zakładzie prowadzone są również hodowle komórkowe in vitro komercyjnie dostępnych linii komórkowych, jak również pierwotnych wyprowadzonych bezpośrednio z tkanek od pacjentów. Obecnie, prowadzone są hodowle nowotworowych linii komórkowych (rak jelita grubego, rak płuc, neuroblastoma, rak trzustki, rak przełyku); hodowle astrocytów ludzkich, mysich oraz szczurzych, hodowle ludzkich komórek sieci beleczkowania, hodowle mysich embrionalnych fibroblastów. Hodowle komórek prowadzone są w odpowiednich warunkach. W tym celu stosuje się inkubatory, w których kontrolowana jest temperatura, stężenie CO 2 oraz wilgotność. Praca z komórkami odbywa się w ściśle sterylnych warunkach pod komorą laminarną. Hodowle te umożliwiają lepsze poznanie podłoża molekularnego wielu chorób poprzez badanie głównych szlaków metabolizmu komórkowego.
Real-Time PCR
Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym, znana również jako ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR), jest techniką laboratoryjną biologii molekularnej opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Monitoruje amplifikację docelowej cząsteczki DNA podczas PCR, tj. w czasie rzeczywistym, a nie na jej końcu, jak w konwencjonalnej PCR. Real-time PCR może być wykorzystany ilościowo (ilościowy PCR w czasie rzeczywistym) i półilościowo, tj. powyżej/poniżej pewnej ilości cząsteczek DNA (pół-ilościowy real-time PCR). Najczęstszym wykorzystaniem metody jest określanie poziomu ekspresji wybranych genów w analizowanych próbkach.
ELISA
Test immunoenzymatyczny jest testem wykorzystującym przeciwciała i zmianę barwy w celu identyfikacji substancji. Antygeny z próbki są przyczepione do powierzchni. Następnie na powierzchnię nanosi się kolejne specyficzne przeciwciało, które może wiązać się z antygenem. To przeciwciało jest połączone z enzymem, a w końcowym etapie dodaje się substancję zawierającą substrat enzymu. Następna reakcja daje wykrywalny sygnał, najczęściej zmianę koloru w podłożu. Przeprowadzanie testu ELISA obejmuje co najmniej jedno przeciwciało o swoistości dla określonego antygenu. Próbka z nieznaną ilością antygenu jest unieruchamiana na stałym podłożu (zwykle na płytce). Po unieruchomieniu antygenu dodaje się przeciwciało wykrywające, tworząc kompleks z antygenem. Przeciwciało wykrywające może być kowalencyjnie związane z enzymem lub może być wykryte przez przeciwciało drugorzędowe, które jest połączone z enzymem poprzez biokoniugację. Pomiędzy każdym etapem, płytkę zazwyczaj przemywa się łagodnym roztworem detergentu w celu usunięcia jakichkolwiek białek lub przeciwciał, które są niespecyficznie związane. Po ostatnim etapie przemywania dodaje się enzymatycznego substratu, aby wytworzyć widoczny sygnał, który wskazuje ilość antygenu w próbce.
W zakładzie Chemii i Biochemii Klinicznej obok badań in vitro prowadzone są również badania na myszach utrzymywanych w Zwierzętarni Wydziału Farmaceutycznego. Nasz Zakład prowadzi badania zarówno na myszach typu dzikiego, jak i na zwierzętach modyfikowanych genetycznie, u których można indukować knock-out genowy poprzez podanie odpowiednich substancji chemicznych. Prowadzone badania, zarówno nad chorobami neurodegeneracyjnymi (choroba Alzheimera, jaskra) jak i nowotworami, mają na celu zarówno poznanie podłoża molekularnego tych chorób, jak również przetestowanie substancji chemicznych mogącymi być potencjalnymi lekami lub substancjami wspomagającymi terapię tych chorób.
